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常规普通PCR常见问题

发布时间:2022-07-04浏览:432次
1.琼脂糖凝胶电泳后无PCR扩增产物条带  
主要表现:Marker及对照条带均正常,但检测样本无条带。  
原因分析:1.反应条件不合适:PCR过程中退火温度过高,退火延伸时间不足,反应循环数过少。  
2.核酸模板浓度或纯度低:普通PCR的检测敏感度有限,样本核酸含量低或者含有抑制物。  
3.反应体系与核酸扩增不匹配:检测体系中的Mg2+浓度,dNTPs量或Buffer与目标核酸扩增所需条件不匹配。  
4.引物设计不当或者发生降解:存在引物二聚体或二级结构,引物稀释后未分装储存条件不适宜或者反复冻融次数过多。  
解决方案:1.优化反应条件,梯度摸索退火温度,延长退火延伸时间,增加反应循环数(30-45区间为宜)。  
2.对核酸模板进行纯化,或使用商业化核酸提取试剂盒进行提取,增加核酸模板的上样量。  
3.优化反应体系(预混体系除外),改变检测体系中的Mg2+浓度及dNTPs用量,更换体系中Buffer。  
4.重新设计引物,避免引物二聚体和链内二级结构,在一次稀释引物后可分装成多支小管,减少反复冻融次数。

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