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聊一聊数字PCR行业的基本概况

发布时间:2022-11-23浏览:90次
  PCR(聚合酶链式反应)是指利用DNA 聚合酶(如Taq DNA 聚合酶)在体外条件下,催化一对引物间的特异DNA 片段合成的基因体外扩增技术。PCR 是生物体外的特殊DNA 复制,最大的特点是能将微量的DNA 大幅扩增。以实时荧光PCR 技术为例,通过PCR 技术进行分子诊断的主要流程包括:
  1. 核酸的提取和纯化:使用核酸提取试剂从病毒、细菌等中提取出DNA;
  2. 核酸在引物约束下特异性的PCR 扩增:在提取的DNA 中加入扩增需要的反应液(酶、复制需要的原料、引物等),在PCR 仪中完成扩增过程;
  3. 扩增产物的检测:通过荧光标记法检测DNA 含量,从而判断病毒DNA 含量,给出诊断结果。
  PCR 技术最大的特点就是灵敏度高、特异性好、及时方便,在基础研究以及医学诊断、法医学和农业科学等各大领域应用广泛。在临床诊断中,PCR 技术具有诸多优势:灵敏度高,靶细胞检出率可达1/100 万,病毒检测灵敏度≥3RFU,最小细菌检出率为3 个,检测样本纯度要低,仅需DNA 粗提取;扩增反应在2-4 小时内完成,使用简便、快捷。
  作为临床诊断的“金标准”技术,PCR 广泛应用于血站核酸检测、疾控核酸检测、临床核酸检测等领域,其中,在传染病诊断和血筛检测中,PCR 技术能缩短诊断的“窗口期”并且可以定量对病原体进行检测,相比于传统的免疫诊断方式,具有不可替代的优势,基于PCR 技术的分子诊断是医院对传染病诊断的“金标准”。
  PCR 经过三代技术更迭,精确度和灵敏度不断提高。PCR 技术最早由穆勒于1985 年发明,经历了第一代定性PCR、第二代定量PCR 和数字PCR 三代技术迭代,其中第二代定量PCR 包括荧光定量PCR(qPCR)以及在其基础上分化出来的ARMS (突变扩增阻滞系统)和HRM(高分辨溶解曲线)。三代技术的主要差异如下:
  ① 第一代定性PCR 技术:采用琼脂糖凝胶电泳对PCR 扩增产物进行分析,存在交叉污染、检测耗时长、只能做定性检测等缺点,目前处于衰退期,已基本被淘汰;
  ② 第二代荧光定量PCR(qPCR)技术:qPCR 在一代定量PCR 的基础上引入荧光探针标记法从而实现定量检测,目前发展成熟、应用广泛、临床普及率高,为现阶段主流应用平台,正处于从成长期向成熟期过渡的阶段,市场增速在20% 以上;
  ③ 第三代数字PCR(dPCR)技术:dPCR 是在PCR 原理的基础上利用芯片和荧光检测技术进行核酸绝对定量检测。芯片技术是dPCR 的核心工艺,利用对样品进行分液处理进而实现“单分子模板PCR 扩增”,达到定量检测的目的,具有更高的精确度和灵敏度,目前处于导入期,市场增速在10%-15%。
  数字PCR仪的工作原理是,通过将含有待测样本的数字PCR反应液分散到成千上万个独立的微反应单元中,在PCR扩增后对每个微反应单元中的荧光信号进行判读,计算出阴性和阳性反应的数量,最后利用泊松分布等统计学公式和软件对结果进行计算分析,从而实现靶标分子的绝对定量。因此,数字PCR不依赖标准曲线定量,并且不受PCR扩增效率影响,具有更高灵敏度和准确度。

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